众所周知，基因功能研究，离不开分子生物学实验，而分子生物学实验又绕不开载体构建。依赖于限制性核酸内切酶的载体构建，其工作原理是分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。目前常用的载体构建系统有：基于TypeII型限制性内切酶的载体构建系统、基于TypeIIs型限制性内切酶的Golden Gate载体构建系统。
与基于TypeII型限制性内切酶的载体构建系统不同，Golden Gate载体构建方法，可实现在单一管内同时进行酶切和连接反应，不需要进行凝胶纯化及分步的酶切、连接反应，大大缩短实验时间，并且重组克隆不会残留酶切位点，真正做到“无缝”拼接，重组效率高。今天小远就为大家重点介绍一下Golden Gate载体构建系统，希望大家看完本文后会对该系统有一个更全面的认识！
背景介绍
Golden Gate载体构建方法最早是由Engler等人在2008年提出的(Engler et al. 2008)。该方法是一种新型的酶切连接方法，与传统的酶切连接不同。传统的酶切连接方法采用标准的TypeII型限制性内切酶（例如Ec++oRI）切割dnA，这些限制酶通常识别4~8bp的回文序列，并在识别序列内部切割产生粘性末端或平末端。而Golden Gate是采用TypeIIs型限制酶（例如BsaI）切割DNA，这些酶是在识别序列以外剪切产生四个碱基的粘性末端（图1）。由于粘性末端不是识别序列的一部分，因此它们可以直接作为连接DNA的片段。在设计无误的情况下，识别位点不会出现在最终的质粒中，达到精确的无缝克隆，连接效率接近100%。此外，四个碱基的特异性末端能用来连接多个片段，从而在一个反应体系中实现多片段的克隆重组。
构建流程
(1)设计引物扩增目的片段
通过PCR向目的片段中引入IIs型限制酶（如BsaI、BsmBI等）的识别序列，识别序列加在引物的5'端，为了确保限制酶能稳定结合到DNA双链上并发挥切割作用，需在识别序列末端加上保护碱基。所加的保护碱基的数量和种类不是固定的，一般3bp的保护碱基就是足够的，但如果为了保险起见，也可以将保护碱基增加至6bp。另外，为了帮助大家更好的设计引物，我司官网专门开发了Golden Gate克隆引物设计网址（http://www.biorun.com/tools/）欢迎大家点击使用。
(2)酶切连接
利用TypeIIs限制性内切酶（BsaI）识别目的片段和载体上的酶切位点，并在酶切位点之外进行酶切。之后，在连接酶的作用下将目的片段和载体进行无缝连接，可实现单片段克隆重组（图1）或多片段重组（图2）。并且，在合适的实验条件和实验设计下，利用Golden Gate可以组装超过20个DNA片段。
图1 利用TypeIIs限制性内切酶进行单片段克隆重组。
图2 利用TypeIIs限制性内切酶进行多片段克隆重组。
小远叨叨
就操作而言，Golden Gate克隆是最简单的方法之一，可在单一管内同时进行酶切和连接反应。并且，因为TypeIIs限制性内切酶剪切的特殊性，该方法的重组效率非常高。但是，在实际的操作中还是有一些注意事项需要提前了解，小远通过日常的实验经验以及阅读相关文献，总结了如下四点注意事项，一起来看看吧！
Golden Gate载体构建避坑指南
（1）DNA片段之间连接的粘性末端序列设计
4个碱基的粘性末端共有256种碱基排列方式，其中回文序列有16种，为了防止粘性末端自连而降低克隆效率，设计时应选用其他240种非回文序列(Engler et al., 2009)。
（2）选择合适的缓冲液
因为内切酶和连接酶同时存在于同一反应体系，所以缓冲液的选择尤为重要。在限制性核酸内切酶4种NEbuffer中，T4 DNA连接酶都具有有效活性（https://www.neb.com/）。因此能够推断，多数情况下反应体系可以考虑首选限制性内切酶的缓冲液。
（3）观察载体的酶切位点
构载体之前好好检查一下，质粒图谱上是否存在设计的酶切位点，存在几个。如果没有，要尽早更换酶切位点。为了避免不必要的消化，所使用的TypeIIs酶的酶切位点不能出现在需要连接的片段中。如果因为情况特殊出现的话，目的片段的剪切要换用其它的TypeIIs型限制酶，并且需要确保酶切后的粘性末端可以与载体进行组装，实验时需要对载体和目的片段分别进行酶切后再进行连接。
（4）控制反应体系中目的片段及载体浓度
在酶切含量一定的情况下，若目的片段及载体的浓度过高，可能会造成不完全酶切。
Golden Gate的应用
（1）合成生物学
随着合成生物学的发展，工程活性材料（ELMs）也出现了很多新的应用领域，利用合成生物学产生的材料具有突出特点，比如色泽、自我修复以及电导率等(gilbert et al., 2019; Tang et al., 2021)，此外，材料的生物可降解性，符合循环发展的理念。为了更好的推进合成生物学的发展，该领域的生物学家们利用Golden Gate克隆技术形成了模块化克隆策略。通过设计独一无二的限制酶切割位点帮助DNA片段按顺序连接，实现了多个DNA组分（启动子、基因、终止子等）在一个反应中准确连接。
例子1
2021年，Goosens等人在Komagataeibacteri 菌中构建了一个基于Golden Gate的标准化模块克隆系统Komagataeibacter Tool Kit（Ktk）（图3），包括单基因系统和多基因系统。为了扩充该系统的范围，作者对不同的启动子进行表征，包括异源启动子和内源性启动子，筛选到J23104和PTac启动子是最强的异源启动子，PTtcA和PHxu是内源性启动子中最强的，同时作者还测试了不同的荧光报告蛋白在上述启动子下的表达强度（图4）。最后，作者利用KTK系统在Komagataeibacteri 中表达生产淀粉样纤维蛋白，作者将源自大肠杆菌淀粉样纤维蛋白生产系统导入Komagataeibacteri 菌内，并结合透射电子显微镜观察Komagataeibacteri 内生产淀粉样纤维蛋白的情况，因为在该菌中存在大量的纤维素，所以作者利用免疫标记来区分淀粉样纤维与纤维素，结果显示，在该菌中检测到有淀粉样纤维蛋白产生（图5），这也证实了该质粒在Komagataeibacteri 中的作用(Goosens et al., 2021)。
图3 KTK克隆系统(Goosens et al., 2021)。（A）KTK克隆流程。（B）载体构建示意图。
图4 用不同启动子驱动KTK系统(Goosens et al., 2021)。（A-B）通过流式细胞术测定的单个细胞的荧光，A图显示由6个不同的异源启动子分别驱动荧光蛋白表达的结果，B图显示由8个内源性启动子分别驱动荧光蛋白表达的结果。（C）不同的荧光报告蛋白（蓝色：cjBlue、红色：eforred和紫色：gfaspurple）在J23104启动子下的表达强度。
图5 在Komagataeibacteri中表达可诱导的Curli系统(Goosens et al., 2021)。（A）大肠杆菌Curli系统的示意图，其中淀粉样纤维蛋白由CsgA的聚合物组装而成，通过CsgB从核到细胞表面。这些蛋白质通过专门的VIII型分泌（T8S）系统（CsgE、CsgF、CsgG）被转移到外膜上，所有蛋白质都通过sec系统被分泌到周质中。（B）载体示意图，D1.1_LuxR和D1.2_Curli被组装到一起，构建出了D2.2_Curli载体。（C）用D2.2_Curli质粒转化的大肠杆菌和Komagataeibacteri培养物中的蛋白质提取物的蛋白质印迹。（D）通过电子显微镜观察到的Komagataeibacteri内产生淀粉样纤维蛋白的情况。（E）野生型（WT）Komagataeibacteri和转化有D2.2_Curli的Komagataeibacteri的平均干表膜重量。
（2）基因组工程
在植物基因编辑中，CRISPR/Cas需要将筛选标记、Cas核酸酶编码基因和gRNA等多个表达元件一同转入植物，因此需要一个快速简便的克隆过程。基于Golden Gate克隆方法的模块化系统为多个DNA组分（启动子、基因、终止子等）的快速组装提供了解决方案。并且，这种载体构建的方法在CRISPR/Cas载体上组装单个/多个sgRNA中被运用到了极致。
例子1
2020年，Hahn等人在Golden Gate克隆方法模块化系统的基础上，开发了一个扩展的Golden Gate克隆工具包，其模块数量增至103个，适用于单子叶植物和双子叶植物基因编辑(Hahn et al., 2020)。扩展的Golden Gate克隆工具包中新增了编码FnCas12a、LbCas12a、cms1核酸酶等元件、进行碱基替换（C-G到T-A和A-T到G-C）的碱基编辑器模块、具有PAM特异性的Cas9变异体（SaCas9、stCas9、ScCas9等）、Pol II和Pol III启动子以及gRNA骨架模块等。该工具包能够组装靶向单个以及多个靶标的CRISPR/Cas构建体，其gRNA在单个Pol III启动子下（图6）或使用多顺反子tRNA-sgRNA（图7）表达。tRNA-gRNA串联排列的多顺反子模块能够高效表达多个gRNA，并在植物中实现同时编辑多个基因组靶标位点，并且该过程无需PCR。作者通过在小麦原生质体中测试 tRNA-sgRNA CRISPR/Cas 载体，最终证实了该模块是有功能的（图8）。
图6 用在单个Pol III启动子下表达的gRNA进行靶向诱变的2级CRISPR/Cas载体示意图(Hahn et al., 2020)。（a）表示含有一个sgRNA的载体示意图；（b）表示含有四个sgRNA的载体示意图。
图7 用多顺反子SpCas9 tRNA-sgRNA系统进行靶向诱变的2级CRISPR/Cas载体示意图(Hahn et al., 2020)。（a）表示含有一个sgRNA的载体示意图；（b）表示含有六个sgRNA的载体示意图。
图8 在小麦原生质体中测试tRNA-sgRNA CRISPR/Cas载体(Hahn et al., 2020)。（a）三个小麦基因被编辑：基因1（同源染色体TraesCS1A02g338200，TraesCS1B02G350600和TraesCS1D02G340400），基因2（同源染色体TraesCs3A02G289300，TraesCS3B02G323900和TraesCS3D02G289100）和基因3（同源染色体Traescs5A02G116500，TraesCS5B02G117800和TraesCS5D02G129600），红色箭头表示20bp sgRNA目标位点。（b）在小麦原生质体中共转携带三种SpCas9变异体（pFH23、pFH66 或 pFH67）之一的Leve 1载体和携带有6种sgRNA的多顺反子tRNA-sgRNA的Leve 1载体（pFH94）。通过 PCR 进行的基因分型结果显示了CRISPR/Cas诱导的片段缺失的情况。
例子2
2020年，张扬等人基于Golden Gate载体构建方法，建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法(张扬，2020)。与传统的构建双靶点CRISPR/Cas9载体的方法不同，在该方法中，只需将设计好的2个sgRNA和1个外源片段用T4 DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可（图9），这大大降低了构建双靶点CRISPR/Cas9载体时操作的复杂性和实验时长。另外，由于该方法构建的CRISPR/Cas9载体不需要经过PCR反应过程，因此在很大程度上降低了外源片段的突变概率。作者使用该方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体，最终获得的阳性率为100%，测序结果显示无突变。
图9 双靶点CRISPR/Cas9载体构建流程图(张扬，2020)。（A）靶点设计示意图。如果靶点1的第1个碱基是A，则在正向靶点引物的5′端加GGC，如果靶点1的第1个碱基是G，则在正向靶点引物的5′端加GTT，反向靶点引物的5′端都是加AAAC；第2个靶点正向靶点引物的5′端加GCC，3′端加GTTTT，反向靶点引物的5′端加CTCTAAAAC。（B-C）载体构建流程图。2对设计好的靶点引物分别变性退火后，与gRNA2-LacZ-PU6a一起连入BsaⅠ线性化的pRC3或pRC6b，即可转化大肠杆菌感受态细胞。
小远叨叨
文章至此就告一段落了，本文主要为大家讲解了Golden Gate的背景优势、构建流程以及应用，相信大家通过阅读本文会对Golden Gate克隆技术有一个新的认识，今后进行无缝克隆的时候可以尝试用一下Golden Gate，真的会惊艳到你！另外，为了帮助大家更好的理解Golden Gate克隆技术的原理，小远专门翻译了一条视频帮助大家理解，大家一定要点击文末彩蛋观看视频哦~
References：
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 2008, 3(11): e3647.
Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, et al. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIS restriction enzymes. PLoS One, 2009, 4(5): e5553.
Gilbert C, Ellis T. Biological Engineered Living materials: Growing Functional Materials with Genetically Programmable Properties. ACS Synth Biol. 2019, 8(1): 1-15.
Goosens VJ, Walker KT, Aragon SM, et al. Komagataeibacter Tool Kit (KTK): A Modular Cloning System for Multigene constructs and Programmed Protein Secretion from cellulose Producing Bacteria. ACS Synth Biol. 2021, 10(12): 3422-3434.
Hahn F, Korolev A, Sanjurjo Loures L, et al. A modular cloning toolkit for genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2020, 20(1):179.
Tang T, An B, Huang Y, et al. Materials Design by Synthetic Biology. Nat.Rev. Mater. 2021, 6: 332.
张扬, 黄维峰, 周菲, 等. 1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法.华中农业大学学报. 2020, 39(03): 9-18.
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